Washington, DC. Smithsonian Enstütüsünde yine bir gece vaktidir. Rehberler evlerine dönmüş, ışıklar kapanmış, okul çağındaki çocuklar çoktan yataklarına gitmişlerdir. Ama eski gece bekçisi Larry Daley'in (Ben Stiller) içini bir şey kemirmektedir ve sonunda kendini akıl almaz bir maceranın içinde bulur. Bu sefer tarih gerçekten canlanmaktadır. Müzede Bir Gece serisinin ikinci filminde, Larry dünyanın en büyük müzesinin koridorlarında inanılmaz bir savaşın ortasındadır. Bu sefer Larry, eski cansız arkadaşlarını, onların sonunu getirebilecek bu durumdan kurtarmalıdır. Duvarlardaki ünlü resimlerden, koridorlardaki roket gemi maketlerine kadar herşeyin kendi aklına göre hareket ettiği bir müzede.
